Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Существенная степень непараллельности указывает на то, что между антителом и антигеном в испытуемом и стандартном образцах имеются различия, и результаты испытания являются недостоверными.
В заместительных иммунологических количественных определениях не должно быть существенных различий между значениями неспецифического связывания и максимального замещения при высокой концентрации испытуемого образца и стандарта. Различия могут указывать на наличие эффектов, связанных с матрицей: ингибированием связывания либо разложением метки.
2.7.2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Активность антибиотика определяют путем сравнения степени угнетения роста чувствительных микроорганизмов под действием испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентрациях.
Стандартные образцы, используемые для количественного определения, представляют собой субстанции, активность которых точно установлена по отношению к международному стандарту.
# Для количественного определения используют ФСО.
Определение должно выполняться способом, позволяющим производить проверку достоверности математической модели, на которой основан расчет активности. Если выбрана модель параллельных линий, линии логарифмической зависимости активности от дозы для испытуемого препарата и стандартного образца должны быть параллельны; они должны быть линейны в области доз, использовавшихся при вычислении. Эти условия должны быть проверены тестами соответствия для определенной вероятности, обычно Р = 0,05.
# Вычисления целесообразно проводить по схеме латинских квадратов (если при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы прямоугольные кюветы) или по схеме рандомизированных блоков (если при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы чашки Петри или анализ проводился турбидиметрическим методом).
Могут быть использованы и другие математические модели, например, модель отношения уклонов прямых, при условии доказательства их достоверности.
Если в частной статье не указано иное, доверительные интервалы ошибки количественного определения активности (Р = 0,95) должны составлять от 95% до 105% от оцениваемой активности.
Определение выполняют методом А или методом В, если иное не указано в частной статье.
А. МЕТОД ДИФФУЗИИ
Питательную среду определенного состава расплавляют, засевают суспензией микроорганизмов, чувствительных к испытуемому антибиотику, при подходящей температуре, например, 48-50°С для вегетативных форм и 65-70°С при использовании суспензии спор. Количество суспензии микроорганизмов выбирают таким образом, чтобы образовывались четко определенные зоны ингибирования требуемого диаметра при концентрациях антибиотика, используемых в определении. Инокулированная среда разливается по чашкам Петри или по прямоугольным кюветам на строго горизонтальной поверхности в количестве, достаточном для формирования однородного слоя толщиной от 2 до 5 мм. Среда может также состоять из двух слоев, из которых только верхний подвергался инокуляции. Чашки хранят таким образом, чтобы не происходило заметного роста или гибели микроорганизмов до использования, а поверхность среды была сухой к моменту использования.
Используя растворитель и буферный раствор, указанный в Таблице 2.7.2.-1, готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие известные концентрации и предположительно равные активности. Растворы наносят на поверхность среды, например, в стерильных цилиндрах из фарфора, нержавеющей стали или другого подходящего материала, или в лунках, сделанных в агаре. В каждый цилиндр или лунку должны быть помещены равные объемы раствора. Кроме того, можно использовать стерильные диски абсорбирующей бумаги подходящего качества; диски пропитывают растворами стандартного образца и растворами испытуемого антибиотика и помещают на поверхность агара.
Для оценки достоверности количественного определения используют не менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика, имеющих равные предполагаемые активности. Предпочтительно использовать ряды доз, меняющихся в геометрической прогрессии.
# Например, в соотношении 1:2:4.
В рутинных анализах, когда линейность системы продемонстрирована в адекватном количестве экспериментов с определением по трем значениям, по согласованию с компетентными органами может считаться достаточным
определение по двум значениям. Однако во всех спорных случаях должно
применяться вышеописанное определение по трем значениям.
Растворы в каждой чашке Петри или прямоугольной кювете располагают статистически предпочтительным образом, кроме чашек Петри малого размера, на которых невозможно разместить больше шести растворов; растворы испытуемого антибиотика (U) и стандартного образца (S) чередуют таким образом, чтобы исключить взаимное влияние более концентрированных растворов.
